3. Kryokonservierung

Nach der Expansion werden die MSC für die Lagerung und den späteren Einsatz kryokonserviert. Dies geschieht durch das Einfrieren der Zellen bei Temperaturen < –150°C in Anwesenheit von Kryoprotektiva wie Dimethylsulfoxid (DMSO). Diese Methode ermöglicht eine langfristige Lagerung der Zellen, ohne deren Lebensfähigkeit zu stark zu beeinträchtigen.

1. Durchflusszytometrische Charakterisierung immunsuppressiv wirksamer mesenchymaler Stromazellen

Die Durchflusszytometrie ist eine leistungsstarke Methode zur Analyse und Charakterisierung von Zellen in Suspension. Dabei werden Zellen in einem Flüssigkeitsstrom einzeln durch einen Laserstrahl geleitet. Die Streuung des Lichts und Fluoreszenzsignale, die durch spezifisch gebundene fluoreszierende Antikörper erzeugt werden, liefern Informationen über die Größe, Granularität und das Vorhandensein bestimmter Oberflächen- oder intrazellulärer Marker. Diese Technik ermöglicht die gleichzeitige Messung mehrerer Parameter pro Zelle und wird häufig in der Immunologie, Onkologie und Stammzellforschung eingesetzt. Durch die hohe Geschwindigkeit und Präzision ist die Durchflusszytometrie ein unverzichtbares Werkzeug zur Untersuchung heterogener Zellpopulationen.

Die durchflusszytometrische Charakterisierung mesenchymaler Stromazellen (MSC) ermöglicht eine genaue Analyse ihrer Oberflächenmarker und damit indirekt auch ihrer Funktion. MSC wirken entzündungshemmend, was sie für eine Therapie der GvhD sowie potentiell von Autoimmunerkrankungen und Transplantatabstoßung interessant macht. Typische MSC-Marker wie CD73, CD90 und CD105 werden durchflusszytometrisch erfasst, während die Expression hämatopoetischer Marker wie CD34, CD45 und CD14 ausgeschlossen wird, um eine möglichst reine MSC-Population zu bestätigen. Immunmodulatorische Moleküle wie HLA-G, PD-L1 und IDO sowie intrazelluläre Proteine wie Interleukin 10 (IL-10) und Transforming Growth Factor β (TGF-β) tragen zur immunsuppressiven Wirkung bei und können mit dieser Methode ggf. ebenfalls analysiert werden. Die Methode ist entscheidend, um MSC für eine klinische Anwendung freizugeben.

2. Bakterielle Kontamination mittels BacT/Alert gemäß Europäischer Pharmacopoeia

Für die Überprüfung pharmazeutischer Produkte auf mikrobielle Verunreinigungen gemäß Europäischer Pharmacopoeia wird an unserem Institut das automatisierte System BacT/Alert 3D eingesetzt. Für die Untersuchung werden Flaschen mit speziellen Nährmedien verwendet, die zur Wachstumsförderung von Mikroorganismen geeignet sind. Die zu testenden Proben werden hierfür in die BacT/Alert-Flaschen injiziert und dann im BacT/Alert-3D-Gerät bebrütet. Für einen definierten Zeitraum werden dann kontinuierlich die CO₂-Werte in den einzelnen Flaschen überwacht. Ein Anstieg des CO₂-Wertes, welcher über einen pH-abhängigen Farbumschlag des Nährmediums detektiert wird, weist dabei auf mikrobielles Wachstum hin. Das BacT/Alert-System liefert innerhalb weniger Tage Ergebnisse, was einen zeitnahen Nachweis mikrobieller Verunreinigungen ermöglicht. Die Anwendung dieser Methode ist entscheidend für die Qualitätssicherung und die Gewährleistung der Sicherheit von Advanced Therapy Medicinal Products (ATMPs) und anderen pharmazeutischen Produkten.

3. Endotoxinmessung mittels LAL-Assay

Von Bakterien produzierte Endotoxine können im Körper schwerwiegende Entzündungsreaktionen auslösen. Um die Abwesenheit von Endotoxinen in pharmazeutischen Produkten, Medizinprodukten und biologischen Proben zu gewährleisten, wird aktuell der sogenannte LAL-Assay (Limulus-Amöbozyten-Lysat) eingesetzt. Dieser Assay basiert auf einer Gerinnungsreaktion zwischen Endotoxin und einem Lysat aus Blutzellen des Pfeilschwanzkrebses (Limulus polyphemus). Diese Reaktion kann je nach verwendetem Testtyp (Gel-Clot, Chromogen oder Turbidimetrie) durch Trübung, Farbänderung oder Fluoreszenz gemessen werden. Der LAL-Assay ist äußerst sensitiv (≤ 1,0 EU/ml) und wird weltweit zur Qualitätssicherung eingesetzt, um die Sicherheit von injizierbaren Arzneimitteln und Medizinprodukten zu gewährleisten.

Neben dem klassischen LAL-Assay wird zunehmend der sogenannte Rekombinante Faktor C (rFC)-Assay als Artenschutz-konforme Alternative zur Endotoxinmessung mittels LAL-Assay eingesetzt. Der rFC-Assay basiert auf einem synthetisch hergestellten, rekombinanten Protein, das den ersten Schritt der Endotoxinkaskade des LAL-Assays nachahmt, ohne auf das Blut von Pfeilschwanzkrebsen zurückzugreifen. Der Test bietet dabei eine vergleichbare Sensitivität und Genauigkeit, kann mit den bestehenden Geräten ausgewertet werden und erfüllt gleichzeitig alle regulatorischen Anforderungen. Da Pfeilschwanzkrebse vom Aussterben bedroht sind, gewinnt der rFC-Assay zunehmend an Bedeutung. Der rFC-Assay soll daher auch an unserem Institut zeitnah den LAL-Assay ablösen.

5. Durchführung von aseptischen Prozesssimulationen (APS, Media Fill)

Aseptische Prozesssimulationen (APS), auch Media Fills genannt, dienen der Validierung aseptischer Herstellungsprozesse sowie der (Re-)Qualifizierung der beteiligten Mitarbeiter, um nachzuweisen, dass während des Produktionsprozesses keine Kontaminationen auftreten. Dabei werden anstelle des eigentlichen (Zwischen-)Produkts geeignete Nährmedien wie Tryptic Soy Broth (TSB-Medium) im Produktionsprozess verwendet, welche das Wachstum von Mikroorganismen unterstützen und welche zu festgelegten Zeitpunkten während der APS als Proben unterschiedlichen Formats entnommen werden. Der gesamte Prozess, von der Befüllung bis zur Verpackung, wird dabei unter realistischen Bedingungen im Reinraum simuliert. Nach der Abfüllung werden die Medien über einen festgelegten Zeitraum inkubiert und auf mikrobielles Wachstum untersucht. Eine erfolgreich durchgeführte APS zeigt, dass der Prozess sicher und unter aseptischen Bedingungen durchgeführt werden kann. APS sind ein integraler Bestandteil der Qualitätssicherung in der Herstellung von ATMPs und anderen pharmazeutischen Produkten.

6. Sterilitätstestung einschließlich Inkubation, Prüfung und Dokumentation nach GxP-Leitlinien

Die Sterilitätstestung dient der Sicherstellung der mikrobiologischen Reinheit von Arzneimitteln und Medizinprodukten. Die Untersuchung der Proben aus aseptischen Prozesssimulationen (APS) erfolgt dabei nach GLP-Leitlinien (Good Laboratory Practice). Die Proben werden über 14 Tage bei festgelegten Temperaturen inkubiert und innerhalb dieser Zeit auf Trübung beobachtet. Die Auswertung erfolgt visuell, indem Trübungen oder Kolonien im Medium nachgewiesen werden. Alle Schritte, von der Vorbereitung über die Inkubation bis hin zur Auswertung, müssen sorgfältig dokumentiert werden, um die Rückverfolgbarkeit und Einhaltung regulatorischer Anforderungen sicherzustellen (Good Documentation Practice, GDP). Ebenso müssen alle Abweichungen und entsprechend getroffene Maßnahmen nachvollziehbar dokumentiert werden.

7. Fertilitätstestung (Growth Promotion Testing) mit Standardkeimen gemäß Europäischer Pharmacopoeia

Die Fertilitätstestung, auch Growth Promotion Test genannt, überprüft die Eignung von Nährmedien zur Unterstützung des Wachstums von Mikroorganismen. Gemäß Europäischer Pharmacopoeia (Ph. Eur.) werden Standardkeime wie Staphylococcus aureus, Escherichia coli und Candida albicans verwendet. Die Fertilitätstestung stellt sicher, dass Nährmedien für die Sterilitätsprüfung und andere mikrobiologische Tests geeignet sind. Dabei werden kleine Mengen der Standardkeime in das Medium eingebracht und über einen festgelegten Zeitraum inkubiert. Ein positives Ergebnis (Trübung) weist Wachstum der Mikroorganismen nach, was die Funktionsfähigkeit des Mediums bestätigt. Diese Prüfung ist essentiell, um die Verlässlichkeit mikrobiologischer Tests sicherzustellen. Neben dem Nachweis von Standardkeimen können regulatorische Behörden auch fordern, dass sogenannte Hauskeime, also Keime, die gelegentlich während des regulären Personalmonitorings nachgewiesen werden, in die Fertilitätstestung mit aufgenommen werden.

3. Bestimmung der SARS-CoV-2-spezifischen Neutralisationskapazität von Serum (Wildtyp und Omikronvarianten)

Die Bestimmung der SARS-CoV-2-spezifischen Neutralisationskapazität von Serum gegen den Virus-Wildtyp sowie die Omikron-Variante dient der Bewertung der schützenden Immunantwort nach einer Infektion mit SARS-CoV-2 oder entsprechender Impfung. Dieser Test erfasst dabei die Fähigkeit der im Serum enthaltenen Antikörper, die Bindung des Virus an ihren natürlichen Rezeptor Angiotensin Converting Enzyme 2 (ACE2) zu blockieren, wodurch eine Infektion verhindert wird. Die Ergebnisse liefern daher Hinweise darauf, wie gut der Körper gegen den ursprünglichen Wildtypstamm von SARS-CoV-2 sowie gegen die später aufgetretene Omikron-Variante geschützt ist. Neutralisationskapazitäten über 30% werden als schützend gewertet, Werte über 70% deuten auf eine starke Neutralisationskapazität hin. Dieser Assay hilft daher, den individuellen Schutzstatus noch differenzierter zu beurteilen als durch bloße Messung der Immunglobulinkonzentrationen im Serum.

Regulatorische B-Zellen (Bregs) sind eine besondere Subpopulation von B-Lymphozyten, die eine zentrale Rolle bei der Modulation von Immunantworten und der Aufrechterhaltung der Immuntoleranz spielen. Sie können eine ganze Reihe von Moleküle freisetzen, darunter Interleukin-10 (IL-10) und Transforming Growth Factorβ (TGF-β), um Entzündungsreaktionen zu dämpfen. Eine spezifische Untergruppe von Bregs, sogenannte GraB-Zellen, ist in der Lage, das proteolytische Enzym Granzym B (GzmB) zu produzieren. Diese GraB-Zellen haben das Potenzial, überaktive Immunzellen direkt zu eliminieren und stehen daher im Fokus unserer Forschungen. Die Induktion regulatorischer B-Zellen wie GraB-Zellen erfolgt dabei durch eine gezielte Stimulation des B-Zell-Rezeptors und nachgeschalteter Signalwege, wobei auch Moleküle wie PMA und TLR-Agonisten eine wichtige Rolle spielen können. GraB-Zellen bieten aufgrund ihrer Fähigkeit, Granzym B freizusetzen und autoimmun wirksame Immunzellen direkt zu eliminieren, vielversprechende therapeutische Möglichkeiten für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen, Transplantatabstoßung, chronische Entzündungen und Allergien. Forschungen der letzten Jahre lieferten entscheidende Einblicke in die Herstellung und Funktion dieser Zellen, so dass in den kommenden Jahren mit der Entwicklung eines GMP-konformen Herstellungsprozesses begonnen werden soll.

1. Gewinnung und Induktion von GraB-Zellen:

Prinzipiell erfolgt die Herstellung von GraB-Zellen durch Gewinnung von B-Zellen von Patienten (autolog) oder von Fremdspendern (allogen) über eine Apherese und magnetische B-Zell-Selektion sowie durch nachfolgende Reifung der B-Zellen über die direkte Stimulation des B-Zell-Rezeptors (BCR) und/oder der nachgeschalteten Signalwege. Verschiedene Stimuli, die direkt auf den BCR wirken oder Downstream-Signale aktivieren, spielen dabei eine entscheidende Rolle bei der Differenzierung von B-Zellen in Granzym B-sezernierende Zellen:

• BCR-Stimulation: Der B-Zell-Rezeptor (BCR) ist ein Schlüsselprotein, das die Aktivierung von B-Zellen steuert. Durch die direkte Stimulation des BCR wird eine Kaskade intrazellulärer Signale ausgelöst, die zur Reifung und Differenzierung von B-Zellen führt. Moleküle wie anti-IgM-Antikörper oder F(ab')2-Fragmente können zur BCR-Kreuzvernetzung verwendet werden, um diesen Prozess zu induzieren. Die Aktivierung des BCR führt zu einer verstärkten Produktion von Granzym B und der Umwandlung von B-Zellen in regulatorische GraB-Zellen. Dies wird insbesondere in Umgebungen beobachtet, in denen B-Zellen durch proinflammatorische Signale wie Interferon-γ (IFN-γ) und IL-21 stimuliert werden.
• PMA (Phorbol-12-Myristat-13-Acetat): PMA ist ein potenter Aktivator der Protein-Kinase C (PKC), eines Enzyms, das an der Signalübertragung nach BCR-Stimulation beteiligt ist. PMA kann zur BCR-unabhängigen Aktivierung von PKC verwendet werden und nachgeschaltete Signalwege initiieren, die ebenfalls zur Induktion von GraB-Zellen führen.
• Toll-like-Rezeptor (TLR)-Agonisten: Zusätzlich zur direkten BCR-Stimulation können Toll-like-Rezeptoren (TLRs) auf B-Zellen aktiviert werden, um die Differenzierung in GraB-Zellen zu unterstützen. TLR9-Agonisten wie CpG-Oligonukleotide fördern in Kombination mit BCR-Stimulation die Induktion von GraB-Zellen und verstärken die Granzym B-Produktion in inflammatorischen Mikroumgebungen.

2. Mechanismen der Immunsuppression durch GraB-Zellen: GraB-Zellen spielen eine wesentliche Rolle bei der Immunsuppression, indem sie Granzym B freisetzen, welches wiederum Apoptose in aktivierten T-Zellen induzieren kann. Granzym B, ein proteolytisches Enzym, ist ursprünglich als zytotoxisches Schlüsselmolekül von T-Zellen und natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) bekannt. Bei GraB-Zellen führt es jedoch im Gegensatz dazu durch proteolytische Spaltung der Zeta-Kette des T-Zell-Rezeptors - und hat hierdurch eine immunsuppressive Wirkung.

Wir konnten zeigen, dass GraB-Zellen besonders effizient überschießende T-Zell-Antworten hemmen können, indem sie aktivierte T-Zellen mittels Granzym B an einer weiteren Proliferation hindern und in die Apoptose leiten. Dieser Mechanismus ist zytokinunabhängig und könnte in spezifischen klinischen Kontexten genutzt werden, in denen eine gezielte T-Zell-Elimination erwünscht ist, wie etwa bei Autoimmunerkrankungen oder Transplantatabstoßungen.

Weitere Untersuchungen zeigten, dass die Fähigkeit von GraB-Zellen zur Immunsuppression durch das Zusammenspiel mit anderen immunsuppressiven Zellen und Faktoren verstärkt werden kann. Dies deutet darauf hin, dass GraB-Zellen in einem komplexen immunregulatorischen Netzwerk eingebunden sind, welches zur langfristigen Immuntoleranz beiträgt.

1. Gewinnung von plasmazytoiden dendritischen Zellen:

Die Gewinnung von pDCs erfolgt in mehreren Schritten, beginnend in der Regel mit einer Lymphozytapherese, einem Verfahren, bei dem angereicherte Lymphozyten aus dem Blutkreislauf eines Spenders entnommen werden. Bei der Apherese wird das Blut des Spenders durch einen Zellseparator geleitet, welcher die gewünschten Zellen separiert und den Rest des Blutes wieder in den Kreislauf des Spenders zurückführt. In einem zweiten Schritt erfolgt dann die Gewinnung von pDCs durch Isolation aus dem gesammelten Lymphozytapheresat. Ein gängiges Verfahren ist dabei die positive magnetische Selektion (MACS) mittels Antikörpern gegen spezifische Marker wie BDCA-2 und BDCA-4, die auf der Oberfläche von pDCs exprimiert werden.

Im Vergleich zu den in klinischen Studien bislang am häufigsten verwendeten Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (mono-DCs), deren ex-vivo-Reifung mindestens 7 Tage in Anspruch nimmt, können pDCs innerhalb von nur 24 Stunden nach ihrer Isolation aktiviert und maturiert werden. Auch deshalb eignen sich pDC als Vakzine oder Vakzineadjuvans besonders gut für potentielle klinische Anwendungen.

Grundsätzlich können pDCs sowohl aus dem Blut von autologen Spendern (z. B. Patienten) als auch von allogenen Fremdspendern (z. B. gesunde HLA-gematchte Spender) gewonnen werden. Zudem besteht die Möglichkeit, pDCs von haploidenten Spendern zu isolieren, also beispielsweise von blutsverwandten Kindern oder Eltern. Die beiden letztgenannten Optionen bieten den Vorteil, dass trotz guter Übereinstimmung des HLA-Profils des Spenders mit dem des Empfängers eine Immunantwort durch potenziell verbleibende allogene Effekte möglicherweise verstärkt werden könnte.

2. Maturierung von plasmazytoiden dendritischen Zellen:

Für eine effektive Aktivierung von pDC ist 2-stufiger Maturierungsprozess erforderlich, welcher bei einer geplanten Anwendung im klinischen Setting im Rahmen einer GMP-konformen (Good Manufacturing Practice) Herstellung im Reinraum durchgeführt werden muss:

• Phase 1: In einer ersten Phase produzieren pDCs zunächst in Reaktion auf verschiedene Zytokine wie Interleukin 3 (IL-3) und IL-10 große Mengen der Serinprotease Granzyme B (GzmB), welches einerseits die Aufnahme und Prozessierung von Antigenen unterstützen kann, andererseits die pDCs aber auch in ein tolerogenes bzw. immunregulatorisches Stadium versetzt, in dem sie T-Zell-Aktivierung eher unterdrücken als fördern.
• Phase 2: In der zweiten Phase erfolgt die eigentliche Maturation der pDCs durch Zugabe von Toll-like-Rezeptor (TLR-) Agonisten und ggf. CD40-Ligand. In diesem Stadium wird GzmB herunterreguliert, während gleichzeitig kostimulatorische Moleküle und MHC/Peptid-Komplexe hochreguliert werden. Die Maturierung mündet in einer hochimmunogenen und reifen Antigen-präsentierenden Zelle (APC). Der gesamte Reifungsprozess kann innerhalb von 24-48 Stunden abgeschlossen werden.

Die Notwendigkeit dieses 2-stufigen Prozesses ergibt sich zum einen aus dem Ziel, eine konsistente und reproduzierbare Aktivierung der Zellen zu gewährleisten, die für klinische Anwendungen entscheidend ist. Andererseits kann eine unzureichend maturierte pDC für die Wirksamkeit eines Vakzins sogar kontraproduktiv sein. Zudem trägt der 2-stufige Prozess potentiell auch zur Reduktion des Risikos unerwünschter Immunreaktionen bei, indem eine kontrollierte und gleichmäßige Aktivierung der pDCs gewährleistet wird.

CAR-T-Zellen (Chimäre Antigenrezeptor-T-Zellen) stellen eine hochinnovative Form der Immuntherapie dar, die entwickelt wurde, um Tumorzellen gezielt zu bekämpfen. Sie kombinieren Eigenschaften von T-Zellen und B-Zellen in einer neuen Art von „Hybridzellen“. Normalerweise erkennen T-Zellen krankhafte Zellen über sogenannte T-Zell-Rezeptoren, die Antigene auf der Oberfläche der Zielzelle erkennen, nachdem sie von anderen Immunzellen präsentiert wurden. CAR-T-Zellen werden genetisch jedoch so modifiziert, dass sie chimäre Antigenrezeptoren (CARs) auf ihrer Oberfläche tragen, die wie ein B-Zell-Rezeptor direkt an spezifische Antigene binden können, ohne dass vorab eine Antigenpräsentation erforderlich ist. Dies verleiht ihnen die Fähigkeit, Tumorzellen eigenständig zu erkennen und zu zerstören, ohne von weiteren externen Signalen abhängig zu sein. Ausgangsmaterial hierfür können entweder Lymphozyten des Patienten selbst (autolog) oder von ausgewählten Fremdspendern (allogen) sein.

1. Herstellung von CAR-T-Zellen in verschiedenen Bioreaktoren:

Die Herstellung von CAR-T-Zellen nach Gewinnung der T-Zellen erfolgt häufig in spezialisierten Bioreaktoren, die eine kontrollierte Umgebung bieten, um die Zellen genetisch zu verändern und zu expandieren. Die Cocoon-Plattform von Lonzaist dabei eine von mehreren Technologien, die die automatisierte und standardisierte Herstellung von CAR-T-Zellen erlauben. Bei der Cocoon Plattfom handelt es sich um ein modulares System, das speziell für die Herstellung autologer CAR-T-Zellen entwickelt wurde. Nach Selektion der T-Zellen, z.B. aus dem Lymphozytapheresat eines Patienten, erfolgt der gesamte Prozess von der genetischen Modifikation bis hin zur Expansion in einer geschlossenen, kontrollierten Umgebung. Dies minimiert das Risiko von Kontaminationen und reduziert die Notwendigkeit manueller Eingriffe. Die dadurch verringerte Arbeitszeit ermöglicht es, Patientenproben parallel in mehreren Bioreaktoren zu verarbeiten, was die Effizienz deutlich steigert.

Im Vergleich zu den in klinischen Studien bislang am häufigsten verwendeten Monozyten-abgeleiteten dendritischen Zellen (mono-DCs), deren ex-vivo-Reifung mindestens 7 Tage in Anspruch nimmt, können pDCs innerhalb von nur 24 Stunden nach ihrer Isolation aktiviert und maturiert werden. Auch deshalb eignen sich pDC als Vakzine oder Vakzineadjuvans besonders gut für potentielle klinische Anwendungen.

Grundsätzlich können pDCs sowohl aus dem Blut von autologen Spendern (z. B. Patienten) als auch von allogenen Fremdspendern (z. B. gesunde HLA-gematchte Spender) gewonnen werden. Zudem besteht die Möglichkeit, pDCs von haploidenten Spendern zu isolieren, also beispielsweise von blutsverwandten Kindern oder Eltern. Die beiden letztgenannten Optionen bieten den Vorteil, dass trotz guter Übereinstimmung des HLA-Profils des Spenders mit dem des Empfängers eine Immunantwort durch potenziell verbleibende allogene Effekte möglicherweise verstärkt werden könnte.

2. Effizienz der Impfstoffe

Die beschriebenen Unterschiede der beiden Impfstofftypen resultieren in variierenden Immunantworten, welche sich auch in der Wirksamkeit der Impfstoffe widerspiegeln. Die Effizienz beider Impfstofftypen wurden in groß angelegten klinischen Studien untersucht. Dabei zeigten mRNA-Impfstoffe eine höhere Schutzwirkung, die bei etwa 94-95% gegen symptomatische COVID-19-Erkrankungen lag, während Vektorimpfstoffe eine Wirksamkeit von nur ca. 60-80 % aufwiesen.

Ein zentraler Befund unserer eigenen Studien war, dass mRNA-geimpfte Personen bereits innerhalb von drei Wochen nach der ersten Impfung signifikant höhere neutralisierende Antikörper-Titer aufwiesen als bei Impfung mit Vektorimpfstoffen. Diese Überlegenheit von mRNA-Impfstoffen gegenüber Vektorimpfstoffen zeigte sich auch in einer stabileren Langzeitimmunität, die auf eine fortschreitende Affinitätsreifung der produzierten Antikörper hindeutet. Zudem konnten wir zeigen, dass bei sogenannten heterologen Impfschemata (d.h. erste Dosis vektorbasiert, weitere Impfdosen mRNA-basiert) eine stabile und langanhaltende Immunität induziert wurde, welche zum Teil auch Schutz gegen die sich später entwickelnden Virusvarianten bot.