ProInnoII

Epigenetische Modifikationen des Genoms wie die Methylierung von Cytosin in Anhäufungen von CpG-Dinukleotiden in den so genannten CpG Inseln oder die Azetylierung der Histonproteine sind in vielen Tumorentitäten häufige Ereignisse. Befinden sich diese Modifikationen innerhalb der Promotersequenz eines Genes, so führt das in der Regel zu einem Abschalten der Genexpression und somit zum Ausfall der Genfunktion. Da in Tumoren besonders solche Gene betroffen sind, die für Zellzyklus-Regulation, DNA-Reparaturmechanismen, Apoptose, Angiogenese und Metastasierung kodieren, wird neben anderen Ereignissen, z.B. Mutationen, Translokationen, die Tumorgenese, Tumorproression und Aggressivität einem Ausfall eines oder mehrerer dieser Gene durch epigenetische Promotermodifikation zugeschrieben.

In diesem Projekt wird der Status der Promotermethylierung in einer Auswahl von Karzinomen aus Lunge, Brust, Kolon, Pankreas, Blase, Leber und Prostata sowie in einer Auswahl von Tumoren mesenchymalen Ursprungs z.B Lipo-, Fibro-, Chondro- und Ewingssarkome und in Hodgkin und non-Hodgkin Lymphomen mittels Pyrosequenzierung und Bisulfitsequezierung bestimmt. Für diese Untersuchungen steht die Gewebebank der Abteilung für Pathologie der Universität Ulm mit seiner umfangreichen, kryo-asservierten sowie Formalin fixierten Gewebesammlung mit der jeweilig dazugehörenden histopathologischen Begutachtung zur Verfügung. Für jede Tumorentität werden 20-30 Fälle ausgesucht, bei denen der Tumoranteil in der Gewebeprobe möglichst hoch ist (> 80%) und neben dem histologischen Befund auch klinische Daten vorhanden sind. Bei Tumoren z.B. Hodgkin Lymphomen, die einen hohen Anteil an nicht-Tumorgewebe enthalten, werden die Tumorzellen mittels Laser-Mikrodissektion angereichert.

Zur Bestimmung des Methylierungsgrades der Promoterregion der Gene wird die Tumor DNA mit Natriumbisulfit behandelt. In dieser Reaktion wird Cytosin zu Uracil desaminiert während 5-Methyl-Cytosin in dieser Reaktion inert ist. In einer anschließenden Amplifikation dieser Promoterregion mittels PCR und Primerpaare, passend auf die umgewandelte DNA, erscheint jedes ursprüngliche Cytosin als Thymidin, während 5-Methyl-Cytosin sich als Cytosin präsentiert. Durch Sequenzierung des PCR Produkts können nun der Methylierungsgrad und die Position der methylierten CpG Dinukleotide in der Promotersequenz des jeweiligen Gens präzise bestimmt werden. Wegen der großen Anzahl an Sequenzierungen bietet sich für diese Studie die neue Technologie der Pyro-Sequenzierung anstelle der klassischen Sequenzierung als Methode der Wahl an.

Wir hoffen, durch diese Studie eine neoplasieabhängige, epigenetisch bedingte Signatur inaktivierter Gene aufzudecken, die Aussagen zur Prognose der Tumorerkrankungen ermöglichen und Hinweise auf den Einsatz neuer Therapieverfahren geben.